高親和力單克隆抗體制備問題及對策

一、單抗制備-骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 培養(yǎng)過程中遇到的問題及對策

1，細(xì)胞長的慢或細(xì)胞死亡
正常生長情況下，細(xì)胞一天傳代一次，生長越好，貼壁越多
對策：①培養(yǎng)基配方不對；② 接種密度太低，低于10的4次方；③污染了支原體或者其他不明細(xì)菌，支原體的現(xiàn)狀是出現(xiàn)小黑點(diǎn)；細(xì)菌污染是渾濁；霉菌污染是出現(xiàn)白色肉眼可見菌落；不明細(xì)菌污染出現(xiàn)砂狀平鋪背景，視野發(fā)暗。④細(xì)胞瓶刷洗不干凈

2，細(xì)胞形態(tài)異常
正常生長情況下，細(xì)胞渾圓，透亮，成對數(shù)生長，生長越好，貼壁多，懸浮少
對策：①培養(yǎng)基配方不對；② 接種密度太低，低于10的4次方；③污染了支原體或者其他不明細(xì)菌，支原體的現(xiàn)狀是出現(xiàn)小黑點(diǎn)；細(xì)菌污染是渾濁；霉菌污染是出現(xiàn)白色肉眼可見菌落；不明細(xì)菌污染出現(xiàn)砂狀平鋪背景，視野發(fā)暗。④細(xì)胞瓶刷洗不干凈

單抗制備-細(xì)胞融合篩選過程中遇到的問題及對策

1，融合率低，陽性孔少
①免疫的問題。由于免疫原性不強(qiáng)或者免疫途徑不當(dāng)造成免疫弱，效價低。
②融合過程中溫度、時間、PEG分子量，作用時間等。
③脾細(xì)胞是否取出了足夠多的細(xì)胞，有無組織碎片干擾。
④融合前骨髓瘤細(xì)胞生長狀態(tài)是否完好，細(xì)胞是否渾圓，透亮，成對數(shù)生長。

2，單抗親和力整體低
①免疫的問題。免疫途徑不當(dāng)或者免疫原問題。
②融合細(xì)胞篩選過程出現(xiàn)遺漏，篩選方法不當(dāng)或檢測方法不當(dāng)，造成沒有篩到高親和力的融合細(xì)胞。
③由于亞克隆細(xì)胞生長環(huán)境不合適，導(dǎo)致融合細(xì)胞染色體丟失，分泌特性改變，親和力從高變低，這時就需要及時更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞增長到一定密度的時候，培養(yǎng)基就開始變顏色，影響融合細(xì)胞的生長，造成染色體丟失；控制好細(xì)胞的密度，密度過大使新加入的培養(yǎng)基不至于很快被消耗，影響融合細(xì)胞的生長，造成染色體丟失；不要過于頻繁操作細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長密度不是很大的時候，不要頻繁操作，否則細(xì)胞容易出現(xiàn)死亡或者生長形態(tài)發(fā)生明顯變化。
操作細(xì)致，防止細(xì)胞被支原體等微生物污染。

3，抗體親和力從高變低
①沒有及時更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞增長到一定密度的時候，培養(yǎng)基就開始變顏色，影響融合細(xì)胞的生長，造成染色體丟失或者性狀改變。
②控制好細(xì)胞的密度，密度過大使新加入的培養(yǎng)基不至于很快被消耗，影響融合細(xì)胞的生長，造成染色體丟失或者性狀改變。
③過于頻繁操作細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長密度不是很大的時候，不要頻繁操作，否則細(xì)胞容易出現(xiàn)死亡或者生長形態(tài)發(fā)生明顯變化。
④細(xì)胞被支原體等微生物污染。
⑤亞克隆次數(shù)超過5次，導(dǎo)致細(xì)胞生長環(huán)境經(jīng)常被改變，弱的陽性雜交瘤細(xì)胞染色體丟失或者性狀改變。

三、單抗腹水制備過程中遇到的問題及對策
1，腹水少或者無腹水產(chǎn)生
①致敏不正確，不正確的使用致敏劑，或者致敏時間與接種雜交瘤的時間相差太久，一般是7-14天，具體看小鼠的腹部情況。

②雜交瘤細(xì)胞或者致敏劑的接種位置不正確，沒有打到腹腔，而是打到了皮下。

③接種的雜交瘤細(xì)胞數(shù)量太少，太多或者細(xì)胞狀態(tài)不好。一般不50萬個細(xì)胞左右為宜。

④建議使用母鼠或者生育過的母鼠制備腹水。
2，腹水沒有效價

①制備腹水的雜交瘤極不穩(wěn)定，打到小鼠身上之前就失去抗體分泌能力或者打到腹腔內(nèi)就失去了分泌能力。

② 致敏小鼠時采用了錯誤的致敏劑。
 ③接種的雜交瘤細(xì)胞數(shù)量太少，或者細(xì)胞狀態(tài)不好。
④ 由于注射方式和部位錯誤，形成了實(shí)體瘤。